01. 什么是通用型iPSCs？
通用型誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）是指經(jīng)過(guò)基因編輯處理，能夠降低免疫原性、避免免疫識(shí)別與攻擊，從而可適用于異體移植的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。此類(lèi)細(xì)胞在異體移植場(chǎng)景中不會(huì)引發(fā)免疫排斥反應(yīng)，具有“現(xiàn)成”可用、經(jīng)濟(jì)高效的特點(diǎn)，能夠?yàn)榇笠?guī)模臨床應(yīng)用提供適合的細(xì)胞來(lái)源，推動(dòng)再生醫(yī)學(xué)及基因治療技術(shù)的發(fā)展。
人類(lèi)白細(xì)胞抗原（HLA）是細(xì)胞表面的關(guān)鍵分子，免疫系統(tǒng)通過(guò)其來(lái)區(qū)分自身和非自身細(xì)胞。在異體移植中，供體與受者的HLA不匹配會(huì)引發(fā)免疫排斥反應(yīng)。通用型iPSCs的構(gòu)建需要對(duì)HLA分子進(jìn)行基因編輯，以減少或消除HLA的表達(dá)，從而避免免疫系統(tǒng)的識(shí)別與攻擊。然而，HLA分子分為I類(lèi)和II類(lèi)，占據(jù)基因組的較大區(qū)域，難以通過(guò)單一基因編輯策略完全刪除。研究發(fā)現(xiàn)，敲除β?微球蛋白（β?M）亞基可以有效抑制HLA-I類(lèi)分子的表達(dá)2，而敲除CIITA轉(zhuǎn)錄因子能夠抑制HLA-II類(lèi)分子的表達(dá)3。通過(guò)聯(lián)合敲除這兩種基因，可以實(shí)現(xiàn)iPSCs中HLA分子的全面抑制。
然而，HLA-I類(lèi)分子的缺失會(huì)導(dǎo)致自然殺傷（NK）細(xì)胞的攻擊性顯著增強(qiáng)，因?yàn)镹K細(xì)胞通過(guò)識(shí)別HLA-I類(lèi)分子上的特定配體來(lái)判斷細(xì)胞是否正常。為了逃逸NK細(xì)胞的攻擊，部分研究嘗試僅保留HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G等亞類(lèi)分子4,5，但這樣的iPSCs仍然無(wú)法完全避免免疫排斥反應(yīng)，僅能視為“半通用”細(xì)胞。因此，構(gòu)建完全通用型iPSCs的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于有效地防止NK細(xì)胞的攻擊1。近期的研究進(jìn)展表明，通過(guò)抑制NK細(xì)胞激活受體（KAR）的配體表達(dá)，例如敲除CD155基因并保留HLA-E分子，可以使iPSCs在逃逸NK細(xì)胞識(shí)別的同時(shí)，仍然保留對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制能力6。然而，NK細(xì)胞通過(guò)多種KAR與不同的配體結(jié)合，且配體表達(dá)水平會(huì)因細(xì)胞類(lèi)型而異，這增加了通用型iPSCs構(gòu)建的復(fù)雜性。
02. 蛋白表達(dá)篩選驗(yàn)證基因敲除或敲低的蛋白編碼序列
流式細(xì)胞術(shù)和ELISA在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白時(shí)存在局限性，傳統(tǒng)Western Blot耗時(shí)且重復(fù)性差。相比之下，Simple Western技術(shù)的Jess平臺(tái)能高效檢測(cè)膜結(jié)合蛋白及細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)蛋白，僅需3 μL iPSCs裂解液即可實(shí)現(xiàn)可重復(fù)定量分析，并可用于篩選殘留Cas9蛋白，保障工程化iPSCs的安全性。
SW 篩選iPSCs中的HLA以及KAR配體敲除：
利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)建了靶向 HLA和KAR配體的基因敲除文庫(kù)（表1）。
表 1 iPSCs 中的基因敲低靶標(biāo)。β?M和CIITA敲除分別抑制HLA-1和HLA-2；BAT3、CD155和MICA為已知KAR配體。CIITA和BAT3為胞內(nèi)定位，其余為表面暴露靶點(diǎn)。
利用SW檢測(cè)篩選文庫(kù)中的β?M和CIITA低表達(dá)的克隆（分別抑制HLA-1和HLA-2）（圖1左）。使用RePlex?模塊通過(guò)NIR熒光通道在第二輪檢測(cè)總蛋白（圖1右）。類(lèi)似方法用于篩選KAR配體表達(dá)（圖2）。
圖 1 Simple Western 篩選 iPSCs 中的 HLA 敲除。RePlex? 模塊用于在探針 1（左）中同時(shí)檢測(cè) β2M 和 CIITA，在探針 2（右）中通過(guò) NIR 檢測(cè)總蛋白。
圖 2 Simple Western 篩選KAR配體敲除iPSCs克隆。RePlex? 模塊用于在探針 1（左）中同時(shí)檢測(cè) BAT3、CD155 和 MICA，在探針 2（右）中通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)總蛋白。
圖3 顯示的是以野生型為對(duì)照，量化各克隆的敲低百分比，并將流式與Simple Western 進(jìn)行對(duì)比。
圖 3 通過(guò)流式及Simple Western敲低靶蛋白的數(shù)據(jù)對(duì)比。數(shù)值表示相對(duì)于野生型對(duì)照的百分比表達(dá)量（野生型表達(dá)量為100%，完全敲低為0%）。靶點(diǎn)CIITA和BAT3未在流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)中展示， 可能是由于它們的細(xì)胞內(nèi)定位導(dǎo)致流式檢測(cè)結(jié)果不可靠。CIITA和BAT3的敲低百分比量化數(shù)據(jù)改在表4中呈現(xiàn)。
Simple Western顯示多數(shù)克隆的靶點(diǎn)敲低率高于流式（圖3，表2）。克隆#7對(duì)5個(gè)靶點(diǎn)的敲低效果最佳（除BAT3為69%外，其余均低于野生型50%）。
表 2 Knockdown of intracellular targets that were unreliably detected by flow cytometry were measured by the Simple Western platform. 數(shù)值表示相對(duì)于野生型對(duì)照的百分比表達(dá)量（野生型表達(dá)量設(shè)為100%，完全敲低為0%）
03. 殘留Cas9篩選
CRISPR-Cas9工程化iPSCs需監(jiān)測(cè)殘留Cas9，Simple Western檢測(cè)顯示所有克隆的Cas9均低于6.4 ng/mL重組對(duì)照（圖4）
圖 4 Simple Western 篩選工程 iPSCs 中的殘留 Cas9
經(jīng)基因改造成為通用低免疫原性供體的iPSCs需在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行功能驗(yàn)證。在此環(huán)節(jié)中，Simple Western技術(shù)相比于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)分析方法，在以下幾個(gè)方面展現(xiàn)出它的優(yōu)勢(shì)：
(1) Simple Western儀器可無(wú)差別檢測(cè)全細(xì)胞裂解液、表面蛋白及純化蛋白，全程僅需3小時(shí)且無(wú)需人工操作。
(2) 傳統(tǒng)Western blot方法可輕松轉(zhuǎn)移至Simple Western平臺(tái)。作為毛細(xì)管電泳免疫分析，其提供尺寸特異性及抗體靶向檢測(cè)，已驗(yàn)證抗體超5,000種。
(3) Simple Western檢測(cè)僅需 3 μL 微量樣本, 無(wú)需延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)。
(4) Simple Western具有高重復(fù)性、高靈敏度及定量分析功能。作為開(kāi)放式毛細(xì)管Western blot技術(shù)平臺(tái)，Simple Western用戶可自由選用任何商業(yè)化或定制抗體，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白及其異構(gòu)體的特異性檢測(cè)。
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